Analisis Pembentukan Struktur Sekunder Dan Tersier Pada Protein

Semakin, pengembang obat mencari ke molekul besar dan khususnya protein sebagai pilihan terapeutik.Formulasi produk obat protein dapat menjadi tantangan, tetapi tanpa pemahaman yang baik tentang sifat struktur protein dan karakteristik konformasi protein khusus yang diformulasikan, hasilnya dapat merusak.Ringkasan teknis ini bertujuan untuk memberikan pembaca gambaran singkat tentang struktur protein. Ini juga akan membahas secara singkat bagaimana struktur protein dapat dipengaruhi selama formulasi dan beberapa metode analitis yang dapat digunakan baik untuk menentukan struktur dan menganalisis stabilitas protein.

Struktur jangka ketika digunakan dalam kaitannya dengan protein, mengambil makna yang jauh lebih kompleks daripada yang dilakukannya untuk molekul kecil. Protein adalah makromolekul dan memiliki empat tingkat struktur yang berbeda - primer, sekunder, tersier dan kuaterner.

Struktur Utama Ada 20 asam L-α-amino yang berbeda yang digunakan oleh sel untuk konstruksi protein. Asam amino, seperti namanya menunjukkan, mengandung gugus amino dasar dan gugus karboksil yang bersifat asam. Difungsionalitas ini memungkinkan asam amino individu bergabung bersama dalam rantai panjang dengan membentuk ikatan peptida: ikatan amida antara -NH2 dari satu asam amino dan -COOH yang lain. Urutan dengan kurang dari 50 asam amino umumnya disebut sebagai peptida , sedangkan istilah  protein atau polipeptida digunakan untuk urutan lebih lama.Protein dapat terdiri dari satu atau lebih molekul polipeptida. Akhir dari sekuens peptida atau protein dengan gugus karboksil bebas disebut terminus karboksi atau C-terminus .Istilah amino-terminus atau N-terminus menggambarkan akhir dari urutan dengan gugus α-amino bebas.

Asam amino berbeda dalam struktur oleh substituen pada rantai sampingnya. Rantai samping ini memberikan sifat kimia, fisik dan struktural yang berbeda ke peptida akhir atau protein. Struktur dari 20 asam amino yang umum ditemukan dalam protein ditunjukkan pada Gambar 1. Setiap asam amino memiliki singkatan satu huruf dan tiga huruf. Singkatan ini biasanya digunakan untuk menyederhanakan urutan tertulis dari peptida atau protein.

Tergantung pada substituen rantai samping, asam amino dapat digolongkan sebagai asam, basa atau netral.Meskipun 20 asam amino diperlukan untuk sintesis berbagai protein yang ditemukan pada manusia, kita dapat mensintesis hanya 10. 10 sisanya disebut asam amino esensial dan harus diperoleh dalam makanan.

Urutan asam amino dari suatu protein dikodekan dalam DNA. Protein disintesis oleh serangkaian langkah yang disebut transkripsi (penggunaan untai DNA untuk membuat utusan RNA untai - mRNA gratis) dan terjemahan (urutan mRNA digunakan sebagai template untuk memandu sintesis rantai asam amino yang membuat sampai protein). Seringkali, modifikasi pasca-translasi, seperti glikosilasi atau fosforilasi, terjadi yang diperlukan untuk fungsi biologis dari protein. Sementara urutan asam amino membentuk struktur utama protein, sifat kimia / biologis dari protein sangat bergantung pada struktur tiga dimensi atau tersier.

Struktur sekunder

Peregangan atau untaian protein atau peptida memiliki karakteristik konformasi struktural lokal yang khas atau struktur sekunder , tergantung pada ikatan hidrogen. Dua tipe utama struktur sekunder adalah α-helix dan ß-sheet.

The α-helix adalah untaian melingkar tangan kanan. Substituen rantai samping dari gugus asam amino dalam α-heliks meluas ke luar. Ikatan hidrogen terbentuk antara oksigen dari C = O dari setiap ikatan peptida dalam untai dan hidrogen dari gugus NH dari ikatan peptida empat asam amino di bawahnya dalam heliks. Ikatan hidrogen membuat struktur ini sangat stabil. Substituen rantai samping dari asam amino cocok di samping kelompok NH.

Ikatan hidrogen dalam ß-sheet adalah antara untaian (antar untai) daripada di dalam untai (intra-strand).Konformasi lembaran terdiri dari pasang untaian yang berbaring berdampingan. Oksigen karbonil dalam satu ikatan ikatan hidrogen dengan hidrogen amino untai yang berdekatan. Kedua untaian dapat berupa paralel atau anti-paralel tergantung pada apakah arah untai (N-terminus ke C-terminus) adalah sama atau berlawanan. The ß-sheet anti-paralel lebih stabil karena ikatan hidrogen lebih baik-aligned.

Struktur tersier

Bentuk tiga dimensi keseluruhan dari seluruh molekul protein adalah struktur tersier . Molekul protein akan melengkung dan memutar sedemikian rupa untuk mencapai stabilitas maksimum atau keadaan energi terendah. Meskipun bentuk tiga dimensi dari protein mungkin tampak tidak teratur dan acak, itu dibentuk oleh banyak kekuatan stabil karena interaksi ikatan antara kelompok rantai samping dari asam amino.

Di bawah kondisi fisiologis, rantai samping hidrofobik asam amino non-polar netral seperti fenilalanin atau isoleusin cenderung terkubur di bagian dalam molekul protein sehingga melindungi mereka dari media berair.Kelompok alkil alanin, valin, leusin dan isoleusin sering membentuk interaksi hidrofobik antara satu dengan yang lain, sementara kelompok aromatik seperti fenilalanin dan tryosin sering berkumpul bersama. Asam amino asam atau sisi-rantai pada umumnya akan terpapar pada permukaan protein karena mereka hidrofilik.

Pembentukan jembatan disulfida oleh oksidasi kelompok sulfhidril pada sistein merupakan aspek penting dari stabilisasi struktur tersier protein, memungkinkan bagian yang berbeda dari rantai protein untuk dipegang bersama secara kovalen. Selain itu, ikatan hidrogen dapat terbentuk di antara kelompok-kelompok rantai samping yang berbeda. Seperti halnya jembatan disulfida , ikatan hidrogen ini dapat menyatukan dua bagian rantai yang agak jauh dari segi urutan. Jembatan garam , interaksi ionik antara situs yang bermuatan positif dan negatif pada rantai samping asam amino, juga membantu menstabilkan struktur tersier suatu protein.

 Struktur kuarterner

Banyak protein terdiri dari beberapa rantai polipeptida, sering disebut sebagai subunit protein . Subunit ini mungkin sama (seperti dalam homodimer) atau berbeda (seperti dalam heterodimer). Struktur kuaterner mengacu pada bagaimana subunit protein berinteraksi satu sama lain dan mengatur diri mereka untuk membentuk kompleks protein agregat yang lebih besar. Bentuk akhir dari kompleks protein sekali lagi distabilkan oleh berbagai interaksi, termasuk ikatan hidrogen, jembatan disulfida dan jembatan garam. Empat tingkat struktur protein ditunjukkan pada Gambar 2.

Stabilitas protein

Karena sifat interaksi lemah yang mengendalikan struktur tiga dimensi, protein adalah molekul yang sangat sensitif. Istilah negara asli digunakan untuk menggambarkan protein dalam konformasi alami paling stabil di situ.Keadaan asli ini dapat terganggu oleh sejumlah faktor stres eksternal termasuk suhu, pH, penghilangan air, kehadiran permukaan hidrofobik, kehadiran ion logam dan geser tinggi. Hilangnya struktur sekunder, tersier atau kuaterner karena paparan faktor stres disebut denaturasi. Denaturasi menghasilkan pengungkapan protein menjadi bentuk acak atau salah lipat.

Protein terdenaturasi dapat memiliki profil aktivitas yang sangat berbeda dari protein dalam bentuk aslinya, biasanya kehilangan fungsi biologis. Selain menjadi terdenaturasi, protein juga dapat membentuk agregat dalam kondisi stres tertentu. Agregat sering diproduksi selama proses manufaktur dan biasanya tidak diinginkan, sebagian besar karena kemungkinan mereka menyebabkan respon imun yang merugikan ketika diberikan.

Selain bentuk-bentuk fisik degradasi protein ini, penting juga untuk menyadari kemungkinan jalur degradasi kimia protein. Ini termasuk oksidasi, deamidation, hidrolisis peptida-obligasi, reshuffle ikatan disulfida dan hubungan silang. Metode yang digunakan dalam pemrosesan dan formulasi protein, termasuk setiap langkah lyophilization, harus hati-hati diperiksa untuk mencegah degradasi dan untuk meningkatkan stabilitas biofarmasi protein baik dalam penyimpanan dan selama pengiriman obat.

Analisa struktur protein

Kompleksitas struktur protein membuat elusidasi struktur protein lengkap sangat sulit bahkan dengan peralatan analitis yang paling canggih. Penganalisis asam amino dapat digunakan untuk menentukan asam amino apa yang ada dan rasio molar masing-masing. Urutan protein kemudian dapat dianalisis dengan cara pemetaan peptida dan penggunaan degradasi Edman atau spektroskopi massa. Proses ini rutin untuk peptida dan protein kecil, tetapi menjadi lebih kompleks untuk protein multimerik besar.

Pemetaan peptida umumnya memerlukan perawatan protein dengan enzim protease yang berbeda untuk memotong urutan menjadi peptida yang lebih kecil di lokasi pembelahan tertentu. Dua enzim yang umum digunakan adalah tripsin dan chymotrypsin. Spektroskopi massa telah menjadi alat yang tak ternilai untuk analisis protein enzim yang dicerna, dengan menggunakan metode pindai sidik jari dan pencarian basis data.Degradasi Edman melibatkan pembelahan, pemisahan dan identifikasi satu asam amino pada suatu waktu dari peptida pendek, dimulai dari N-terminus.

Salah satu metode yang digunakan untuk mengkarakterisasi struktur sekunder protein adalah spektroskopi dichroism melingkar (CD). Berbagai jenis struktur sekunder, α-helix, ß-sheet dan kumparan acak, semua memiliki karakteristik spektra dichroism melingkar di wilayah far-uv spektrum (190-250 nm). Spektrum ini dapat digunakan untuk memperkirakan fraksi seluruh protein yang terdiri dari setiap jenis struktur.

Analisis yang lebih lengkap dan beresolusi tinggi dari struktur tiga dimensi protein dilakukan dengan menggunakan kristalografi sinar-X atau analisis resonansi magnetik nuklir (NMR). Untuk menentukan struktur tiga dimensi protein dengan difraksi sinar-X, diperlukan kristal tunggal yang besar dan teratur. Difraksi sinar-X memungkinkan pengukuran jarak pendek antar atom dan menghasilkan peta kerapatan elektron tiga dimensi, yang dapat digunakan untuk membangun model struktur protein.

Penggunaan NMR untuk menentukan struktur tiga dimensi suatu protein memiliki beberapa keunggulan dibandingkan difraksi sinar-X dalam hal itu dapat dilakukan dalam larutan dan dengan demikian protein bebas dari kendala kisi kristal. Teknik NMR dua dimensi yang umumnya digunakan adalah NOESY, yang mengukur jarak antara atom melalui ruang, dan COESY, yang mengukur jarak melalui ikatan.

Analisa stabilitasi pada protein

Banyak teknik berbeda yang dapat digunakan untuk menentukan stabilitas suatu protein. Untuk analisis pengungkapan protein, metode spektroskopi seperti fluoresensi, UV, inframerah dan CD dapat digunakan.Metode termodinamika seperti differential scanning calorimetry (DSC) dapat berguna dalam menentukan pengaruh suhu terhadap stabilitas protein. Pemetaan peptida komparatif (biasanya menggunakan LC / MS) adalah alat yang sangat berharga dalam menentukan perubahan kimia pada protein seperti oksidasi atau deamidasi. HPLC juga merupakan sarana yang sangat berharga untuk menganalisis kemurnian protein.Metode analitik lainnya seperti SDS-PAGE, iso-electric focusing dan elektroforesis kapiler juga dapat digunakan untuk menentukan stabilitas protein, dan bioassay yang sesuai harus digunakan untuk menentukan potensi protein biofarmasi. Keadaan agregasi dapat ditentukan dengan mengikuti ukuran “partikel” dan instrumen tersusun sekarang tersedia untuk mengikuti ini dari waktu ke waktu dalam berbagai kondisi.

Berbagai metode untuk menentukan stabilitas protein kembali menekankan kompleksitas sifat struktur protein dan pentingnya mempertahankan struktur itu untuk produk biofarmasi yang sukses.

Permasalahan:

1.      Mengapa protein adalah molekul yang sangat sensitif? jelaskan
2.      protein alamiah memiliki struktur alamiah yang khas dan disebut protein native (native protein ), coba anda jelaskan apa itu protein native ?

3.   Apa Salah satu metode yang digunakan untuk mengkarakterisasi struktur sekunder protein? Mengapa menggunakan metode tersebut jelaskan

4.      Jelaskan apa yang dikmaksud dengan denaturasi protein dan apa yang menyebabkan terjadinya denaturasi protein ?